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人膜攻擊復(fù)合物（MAC）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用

目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)

液體樣本中膜攻擊復(fù)合物（MAC）的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人膜攻擊復(fù)合物（ MAC）水平。用純化的人

膜攻擊復(fù)合物（MAC）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入膜

攻擊復(fù)合物（MAC），再與 HRP標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，

經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在  HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下

轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的膜攻擊復(fù)合物（ MAC）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在

450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中人膜攻擊復(fù)合物（MAC）含

量。

試劑盒組成：

試劑盒組成

說(shuō)明書(shū)

48孔配置

1份

96孔配置

1份

保存

封板膜

2片（48）

1個(gè)

2片（96）

1個(gè)

密封袋

酶標(biāo)包被板

標(biāo)準(zhǔn)品：135pg/mL

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

酶標(biāo)試劑

1×48

1×96

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

0.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3ml×1瓶

（20ml×20倍）×1瓶

0.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6ml×1瓶

（20ml×30倍）×1瓶

樣品稀釋液

顯色劑 A液

顯色劑 B液

終止液

濃縮洗滌液

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固  10-20分鐘，離心  20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上

清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇   EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合  10-20分鐘后，離心

20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次

離心。

3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心   20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程

中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

1

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心  20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/

分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞

濃度達(dá)到 100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心  20分

鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/span>

用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的  PBS（PH7.4），用手工或勻漿器

將標(biāo)本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待

檢測(cè)，其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上

進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因    NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)

準(zhǔn)品 100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二

孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，

混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉，再各取  50μl分別加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

取 50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液  50μl，混

勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)

品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，

濃度分別為 90 pg/mL，60 pg/mL，30  pg/mL，15 pg/mL，7.5 pg/mL）。

加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣

品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣

品zui終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混

勻。

2.

3.

4.

5.

溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30分鐘。

配液：將 30（48T的  20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的  20倍）倍稀釋后備用。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此

重復(fù) 5次，拍干。

6.

7.

8.

9.

加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

溫育：操作同 3。

洗滌：操作同 5。

顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15分鐘.

10.終止：每孔加終止液   50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止

液后 15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡  15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未

用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間

控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本  OD值

2

大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)

算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10.如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的  OD

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的 OD值

代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋

倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為  0.95以上。

2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和  11%

檢測(cè)范圍：

3 pg/mL -120 pg/mL

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月

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